Applications of stem cells and acellular nerve scaffolds in the repair of long-segment peripheral nerve defects

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.21.021

Abstract

Abstract:

BACKGROUND: Transplanting seed cells into suitable vehicle materials can construct tissue-engineered nerve bridging graft with bioactivity and corresponding function. Tissue-engineered nerve bridging graft from stem cells and acellular allogeneic nerve is becoming a important transplanted substance in the field of long-segment peripheral nerve defects, and has been some promising prospect.
OBJECTIVE: To summarize the application of stem cells and the acellular allogenic acellular nerve scaffold in the peripheral nerve deficit
METHODS: A computer-based search of PubMed and CNKI was performed by the authors to retrieve articles concerning stem cells and acellular allogeneic nerves in the repair of long-segmental peripheral nerve defects published from January 1998 to February 2014. The keywords were “stem cells, peripheral nerve defect, acellular allogeneic nerves” in English and Chinese, respectively. Totally 1 013 literatures were retrieved, among which 97 met the inclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: First, stem cells converge at the lesion site because of their own chemotaxis and various chemotactic factors released after tissue lesion to secrete a large amount of nutrients that can promote the reparation of the damaged nerve function. Secondly, with the help of the surrounding environment and the intrinsic differentiation bias, stem cells can differentiate and replace the damaged and dead nerve cells. Besides, stem cells transplantation combined with tissue engineering materials can reduce glial scar formation, and promote the repair of peripheral nerve defects. Stem cells can enhance the junction between nerve synapses and create a new neural circuit. Neural stem cells have the potential of differentiating into other nerve cells. However, the differentiation and regulation mechanism is not explicit. There is no effective way to improve the microcirculation in order to turn more stem cells into neurons and oligodendrocytes and maintain the cellular activity. So, the effective inhibition of the immune rejection in early stage after transplantation is the key of our study. After the nerve transplantation, how to improve the speed and quality of the neuranagensis and maintain the tissue structure and function of the target organ needs a long way of fumble.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: stem cells, neural stem cells, transplantation, peripheral nerves

CLC Number:

R318

Chi Hao-tian, Yang Yun-kang. Applications of stem cells and acellular nerve scaffolds in the repair of long-segment peripheral nerve defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(21): 3398-3405.

Figures/Tables 1

2.1 种子细胞——干细胞随着干细胞研究的深入，以干细胞作为种子细胞越来越受到研究者的重视。Heath[9]认为干细胞作为种子细胞免疫原性较低，可减少甚至不必使用免疫抑制剂；干细胞可转化为类许旺细胞，改善细胞再生，增加移植组织与周围组织的相容性。 2.1.1 胚胎干细胞胚胎干细胞是一种未分化的全能细胞，在体外特定条件下能无限增殖并保持不分化，经诱导后可以分化为体内任何一种细胞。利用胚胎干细胞的分化潜能可以为组织工程和细胞移植治疗提供良好的细胞来源。Brustle等[10]认为通过胚胎干细胞培养技术产生的神经桥接体，将为周围神经缺损修复提供无限的供体来源。但人胚胎干细胞来源存在免疫排斥问题及伦理学争议，并且胚胎干细胞的定向分化等问题仍待进一步研究，故在周围神经损伤修复领域的应用还相当有限。 2.1.2 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞具有低免疫原性、自我更新能力且能向多个方向分化[11-12]，可作为组织工程和再生医学理想的种子细胞，参与组织重建和疾病治疗[13-15]。骨髓间充质干细胞在体内和体外均可以被诱导分化为具有神经元或胶质细胞表型的细胞[16]，在体外一定条件下可向许旺细胞样细胞分化[17-20]，并分泌神经营养因子，促进轴突的再生。骨髓间充质干细胞还能调节许旺细胞，促进周围神经再生[21]。总结起来，骨髓间充质干细胞作为种子细胞具有以下优势：①来源广泛、取材方便、对人创伤性较小。②易在体外培养、扩增和诱导。③细胞处于未分化状态，增殖能力强，可在体外培养中大量增殖，在一定诱导条件下可以分化成神经细胞。④取自自体，克服了使用胎儿组织所带来的伦理和免疫学方面的问题。故其在神经损伤修复方面具有广阔的应用前景。但骨髓间充质干细胞也存在某些问题，如骨髓间充质干细胞虽具有免疫抑制作用，但也削弱了宿主对肿瘤细胞的免疫监视，增加了肿瘤发病的概率[22]。另一方面，骨髓间充质干细胞的不断增殖也会逐渐地降低其分化潜能[23]。骨髓中间充质干细胞含量低，且随着年龄增长其干细胞数量和增殖能力也显著下降，因而限制了其在临床的广泛应用。 2.1.3 胎盘间充质干细胞胎盘与脐带属于胚胎外组织，存在大量多向分化的干细胞，具有间充质干细胞的特性[24]，细胞生长扩增速度快；因依赖母体免疫系统进行保护，而胚胎自身免疫系统相对不发育，MHC表达低下[25]。胎盘及脐带都属废弃物，所以取材方便，来源丰富，无伦理学问题。因此，脐带干细胞作为组织工程的种子细胞，具有不可多得的优势和前景。但胎盘间充质干细胞虽能多向分化，但要令其大量向神经细胞方向分化并维持可增殖活性却相当困难。故其在神经损伤修复方面的应用还相当有限。 2.1.4 神经干细胞神经干细胞存在于哺乳动物的胚胎和成体器官组织，表达特殊标志蛋白Nestin。这些干细胞一般处于静止或缓慢生长状态，在损伤之后，干细胞可以很快扩增以取代失去的细胞，同时仍保留一部分备用。有学者将神经干细胞的特性概括为[26]：低免疫源性；能自我更新；有趋化作用；具有多分化潜能，能在多区域以恰当的方式产生神经系统的3种主要细胞(神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞)。神经干细胞在体外与具有三维管状立体结构的桥接物共培养后有较高的细胞黏附率，并且神经干细胞保持良好活性[27]。不同源性的神经干细胞，其内在分化方向会有所不同[28]。也有诸多研究证实，神经干细胞在体外构建的培养环境或移植后在体内微环境的作用下可以出现多种不同的分化结果。神经干细胞作为治疗神经系统疾病的来源细胞，其效果已得到广泛的证实。神经干细胞可直接作为移植物，移植后能在体内趋化迁移。有研究表明，对于脱髓鞘疾病动物模型，通过不同途径移植的神经干细胞可到达受损组织区域，从而改善临床症状[29，6]。另外，雷正旺等[30]发现神经营养素3基因修饰的神经干细胞使轴突再生速度加快，并可在一定程度上缓解失神经支配的肌肉萎缩，其原因可能是内源性神经营养因子缓解了因神经连续性中断神经元缺乏神经营养因子的不利因素[31]，使这更拓展了神经干细胞在周围神经长段缺损中的应用范围。 2.2 脱细胞异体神经支架自1878年Albert首次报道人类异体神经移植以来，为人们提供了新的移植材料。作为天然材料，异体神经在结构上接近自体神经，具有正常神经的三维结构，有其他任何移植替代材料不可比拟的优势[32-33]。但是细胞免疫介导的免疫排斥反应问题给同种异体神经移植带来巨大的阻碍，严重影响了移植效果[34-35]。Evans等[36]通过实验证实，同种异体神经的主要相容性抗原存在于许旺细胞、髓鞘及组织间隙细胞，其中许旺细胞抗原性最强。因此，目前异体神经处理方法主要是使神经的细胞成分去除或失活，以降低同种异体神经的抗原性，同时保留对轴突生长有促进作用的基底膜板层素，以利神经再生。理想的去细胞神经移植物应达到以下要求[37]：①清除所有细胞、髓鞘及其崩解碎片，以降低抗原性。②保留由神经外膜、束膜和内膜组成的胶原性管状结构，成为良好的轴突再生通道。③保留基底膜以诱导和增强宿主干细胞迁移及轴突再生[38]。 2.2.1 异体神经的脱细胞处理所谓的脱细胞神经处理即采用化学试剂(溶血性磷脂胆碱、三硝基甲苯X-100、脱氧胆酸钠和氢氧化钠等)或物理方法(低温冷冻、反复冻融或放射辐照等)去除异体神经中的许旺细胞、髓鞘、轴突及神经束膜和外膜的细胞，以清除供体神经的免疫原性，使其剩余的主要成分为以许旺细胞基膜管为主，神经束膜和外膜的基质为外套的完整三维立体支架，保留了对轴突生长有促进作用的基底膜板层素，以修复损伤周围神经的生物技术[39-40]。物理法脱细胞处理：物理方法处理神经包括冷冻法[41]、冻干法[42]、冻融法[43]、乙醇处理法[44]、神经预溃变法[45]、放射辐照等方法[46]。物理方法处理神经的机制是：神经组织抗原集中在细胞表面，通过物理方法处理神经可破坏细胞表面的抗原，降低神经的抗原性，同时保留完整的神经基膜管结构，从而达到可用于移植、引导神经再生的目的，原因即所谓“免疫宽容”[47]。冻融灭活的物理方法制备的异体神经由于降低了许旺细胞的活性或灭活了移植体内大部分许旺细胞，降低了抗原性，同时又保存了基底膜管的完整性，为再生轴突提供一个通过移植体的附着面，从而使其用于桥接一定长度的周围神经缺损取得成功。王秋根等[48]报道同种异体神经经-196 ℃冷冻处理后神经中许旺细胞活性降低，无明显抗原性。国外有文献报道异体神经单纯冷冻保存4周就可提高神经再生效果并缓解免疫排斥反应[49]。李建兵等[50]通过研究后认为放射辐照能够降低异体神经的抗原性，并认为其作用机制可能是利用X射线杀死许旺细胞，破坏其继续分泌抗原物质的功能，并通过保留的神经膜管结构支架使周围神经得以再生。化学萃取法脱细胞处理：化学方法的原理是利用表面活性剂，使细胞溶解于溶液中，达到有效清除神经中的细胞及髓鞘的目的，且最大限度保存细胞外基质结构。利用化学萃取法处理动物周围神经得到的脱细胞异体神经，已证实可较好地消除免疫原性并保留神经的天然立体结构及能促进神经再生的层粘连蛋白等有效成份，在体外培养中支持种子细胞的黏附、生长及分泌神经营养因子[51]，因此更适合在移植中应用[52]。化学处理法为临床寻找理想的自体神经移植替代物开辟了新的途径。 Dumont[53]与Sondell等[54]用去污剂溶血性磷脂胆碱、三硝基甲苯X-100(Triton X-100)溶液和脱氧胆酸钠溶液化学处理鼠坐骨神经，经髓鞘染色、免疫组化染色及扫描电镜等观察，证明此方法可清除所有的细胞和髓鞘等结构及其崩解碎片，而神经基膜管得以完整保留。孙慧哲等[55]对该制品成分进行分析，认为经该方法处理后，清除了许旺细胞、神经外膜和束膜的细胞，以及神经纤维的髓鞘和轴突，保存了由许旺细胞基膜管以及神经外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构，并含有层粘连蛋白、纤维粘连蛋白以及生长相关蛋白GAP-43等促进和诱导受体损伤神经再生的重要成分。衷鸿宾等[56-57]建立了粗大、长段去细胞神经的化学萃取方法，为该项技术的临床应用打下基础。卢世璧等[58]公开了一种组织工程神经支架及其制备方法和应用。首先采用一般化学萃取法去除引起排斥反应的主要抗原--细胞、轴突和髓鞘，然后采用软骨素酶ABC去除异体神经中的硫酸软骨素蛋白多糖，得到细胞外基质的基底膜管保持完整的去细胞异体神经作为组织工程神经支架。该组织工程神经支架适合修复大鼠、兔、犬、人类等周围神经缺损，对促进轴突再生作用非常明显，并且可以增加修复周围神经缺损的长度，是很好的神经移植医用材料。 2.2.2 脱细胞异体神经支架在周围神经缺损中的应用神经的再生过程中没有穿透性，如果遇到障碍神经再生就会停止，因此通过生物或非生物材料制成的导管桥接周围神经缺损，可为损伤神经提供再生的通道，并且有效地阻止周围组织的长入及瘢痕形成而影响再生的效果。理想的周围神经组织工程支架材料应该具有以下特质：①良好的生物相容性与生物降解性。②具有三维立体多孔结构。③良好的可塑性和一定的机械强度。④良好的材料-细胞界面。在众多的自体神经移植替代材料中，去细胞异体神经显示出了良好的应用前景，具有不可或缺的地位[59-63]。物理方法制备的异体神经由于降低了许旺细胞的活性或灭活了移植体内大部分许旺细胞，同时又保存了基底膜管的完整性，为再生轴突提供一个通过移植体的附着面，促进神经的再生，从而使其用于桥接一定长度的周围神经缺损取得成功[64-66]。但物理法使细胞崩解后产生的碎片成分仍然存在，具有抗原性，一方面阻碍周围神经的再生，一方面诱导免疫排斥反应进一步破坏周围神经再生的进程[67]。Maekinllon等[68]曾对几种主要物理处理方法进行评价，结果发现冷冻和预溃变处理抗原性无明显降低，冻干法和大剂量放疗虽能降低抗原性，但因结构损害神经再生差。针对移植神经的组织特性，国内外大多学者认为化学法萃取处理的异种神经移植修复周围神经缺损的效果较好，优于物理法[69-70]。李跃军等[71]应用兔到鼠的动物模型对异种周围神经移植进行研究，发现经化学去细胞处理的异种神经移植修复周围神经缺损后，再生的神经纤维数量和直径与自体神经移植组无差异，故认为利用化学萃取技术处理的兔神经基膜管支架移植修复大鼠的周围神经缺损的效果较好。Sondell等[54]通过鼠的坐骨神经移植实验表明，化学去细胞神经能够诱导宿主许旺细胞向移植段内渗透、迁移和增殖，以及促进轴突沿着空的基底板层向远端迁移和生长。于海龙等[72]将软骨素酶ABC处理后的化学去细胞异体神经用于修复大鼠20 mm坐骨神经缺损，发现周围神经缺损的修复长度得到了有效的增加。郭义柱等[73]对人类新鲜周围神经(长段尺神经)进行化学萃取，并使用该脱细胞神经制品为周围神经缺损的患者进行神经移植，术后3-16个月定期对患者进行功能检查，发现改善率达到64%，为进一步创建异体神经库开辟了道路。脱细胞神经作为支架材料能有效修复神经缺损的机制可能是：①空的基膜管为再生轴突提供了低阻力的接触性引导通道，即“抽吸作用”，同时有利于远侧神经段内营养因子的趋化作用[74-75]。②减少了巨噬细胞清理细胞碎片的时间，使神经再生延迟时间缩短。③构成基膜管的层粘连蛋白等成分促进轴突生长和许旺细胞迁移[76]，促进移植物快速血管化[77]。己有研究证实，天然脱细胞异体神经组织工程支架能为细胞提供近似体内的自然微环境[78-79]。但是，单纯脱细胞神经只能修复有限距离的神经缺损[80]，不同物种，修复极限距离不完全相同。在大动物模型，大多数研究都将移植最大距离不越过3 cm[81-82]。其原因是，脱细胞神经修复缺损时是依靠移植体近侧和远侧自体神经内许旺细胞迁移，其迁移的距离和数量可能存在一定限度，影响了移植效果。 2.3 干细胞与脱细胞异体神经移植治疗周围神经缺损的途径干细胞作为理想的移植种子细胞，目前其常见的移植方法有[83]：①细胞悬液立体定位注射。该法把干细胞全部集中到病灶及其周边发挥治疗作用，但有容积占位效应，容易造成病灶新的损伤。②生物材料吸附移植法。该法可使干细胞与移植材料较好联合，同时解决容积占位效应，但是该法不易追加干细胞剂量。③静脉内细胞悬液输入法和细胞悬液蛛网膜下腔注射法。这两种方法创伤小，可多次追加治疗剂量，但是难以控制干细胞的去向，且到达病灶的细胞数量比例低。此外干细胞移植的时机也是关系到移植成败的一个重要因素。移植神经有两种修复方法，一种是缺损模型制作后立即端端吻合，另一种是模型制作后一至两周再进行吻合。因此，干细胞与脱细胞异体神经联合移植时，主要途径与方法有：①干细胞注射入肌肉，血管，脑脊液，移植神经端端吻合。②干细胞注射入神经后移植。③神经移植后再注射入神经。④干细胞注射入神经后共培养再移植。 2.4 干细胞联合脱细胞异体神经在周围神经长段缺损修复中的应用 Fox等[84]实验发现，脱细胞神经进行宿主再细胞化后进行异体神经移植修复大鼠周围神经较短缺损，效果与不进行宿主再细胞化的脱细胞神经差异无显著性意义。提示在修复较短缺损(<3 cm)时，可能再细胞化意义不大。但随移植长度增加，疗效有下降趋势[85]。修复较长缺损(>3 cm)时，再细胞化可能会弥补宿主细胞迁移能力的不足。杨小华等[86]用种植胎兔许旺细胞的去细胞同种异体神经复合体修复兔缺损的坐骨神经，发现其对神经再生及功能恢复有较好的促进作用，并且免疫原性非常小，效果优于单纯去细胞同种异体神经移植。何红云等[87]运用骨髓间充质细胞构建的组织工程神经修复大鼠10 mm坐骨神经缺损，发现其效果优于单纯的脱细胞同种异体神经移植物，证明骨髓间充质细胞作为种子细胞在周围神经组织工程中具有较强的应用价值。赵趌等[88]将骨髓间充质干细胞复合在化学去细胞异体神经周围，术后8周发现实验组坐骨神经指数、小腿三头肌湿重恢复率、有髓神经纤维总数、小腿三头肌纤维面积、髓鞘厚度等均优于对照组(未添加骨髓间充质干细胞)，证明添加骨髓间充质干细胞生物蛋自胶复合物的化学去细胞异体神经可提高周围神经损伤修复效果。孙晓红等[89]研究发现，许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养后移植于大鼠坐骨神经缺损能达到较满意的功能与结构的修复。Hu等[90]用猕猴骨髓间充质干细胞或干细胞作种子细胞，与去细胞同种异体神经构建组织工程化周围神经修复猕猴尺神经40 mm缺损，结果发现，术后6个月，所有6只动物损伤的神经从结构和功能上都得到恢复，与植入自体干细胞的去细胞异体神经移植和自体神经移植的恢复效果相似。Wang等[91]同样以复合自体间充质干细胞的去细胞异体神经移植物来修复(恒河猴)周围神经缺损，发现间充质干细胞在体内可分化为干细胞样细胞，复合自体间充质干细胞的去细胞异体神经移植为轴突的再生和髓鞘化提供了良好的微环境，其促进神经再生和功能恢复明显优于未复合自体间充质干细胞的去细胞神经移植物。神经干细胞联合异体神经移植在周围神经长节段损伤修复中的应用价值已越来越多地引起神经科学研究者的重视，并已取得了较理想的效果。有报道将神经干细胞在体外培养分化成的类许旺细胞移植到大鼠坐骨神经，可以提高坐骨神经修复的效果，但该法的免疫排斥问题的解决效果仍值得商榷[92]。崔勇等[93]利用冻干去细胞同种异体神经种植由神经干细胞分化的类许旺细胞修复坐骨神经缺损，发现移植物无明显抗原性，且具有较理想的桥接物功能，疗效接近自体神经移植组。对于移植后干细胞在人体内发挥作用的具体机制尚在研究探索之中，但是根据国内外同行前期大量动物实验的结果进行归纳，可总结如下可能机制[94]：第一，干细胞因组织损伤后释放的各种趋化因子吸引以及其自身趋化作用聚集到损伤部位，分泌大量的营养物质，促进机体损伤神经功能的修复；第二，干细胞可以在周围环境的诱导和内在分化偏向共同作用下分化并代替人体内损伤或死亡的神经细胞。此外，干细胞联合组织工程材料移植，减少胶质瘢痕的形成也是促进周围神经损伤修复的因素。第三，干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路。而更多研究表明干细胞与组织工程化神经导管联合移植在动物体内后，干细胞可分泌多种神经营养及生长因子[51]，可补充神经连续性中断后缺乏的神经营养及生长因子，促进原有神经轴突长入组织工程化神经导管。而另一方面，干细胞可在导管内分化为神经元细胞，为神经修复直接补充神经元胞体和轴突[95-96]。且组织工程化神经导管可与干细胞有好的生物相容性，并随着神经纤维的生长降解。"

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